ELISA定性测定结果的判断主要围绕受检标本中是否存在待测抗原或抗体进行判断,结果以"阳性"和"阴性"进行表示。"阳性"表明该标本在测试系统中有反应,而"阴性"则表明无反应。通过此定性判断方法,我们也可以间接获得半定量结果,用滴度表示反应的强度,尽管实质上仍然属于定性试验。在半定量测定中,经过一系列稀释的标本用于测试,呈现阳性反应的稀释度即定义为滴度。依据滴度的高低,我们能够判断标本的反应强度,相比直接观察未稀释标本的颜色深浅,这种方法具有更明确的量化意义。
在间接法和夹心法的ELISA实验中,阳性孔的颜色通常比阴性孔深,而在竞争法的ELISA中则相反,阴性孔的颜色较深。以下分别介绍这两类反应的结果判断方法。
间接法和夹心法
这类反应的定性结果可以通过肉眼判断。无色或接近无色的样本被判定为阴性,而显色明显的样本则被判定为阳性。然而,在ELISA实验中,正常人血清反应后常常会出现背景显色现象,背景的深浅因试剂的组成和实验条件而有所不同,因此实验中必须设定阴性对照,其组成应为不含受检物的正常血清或类似材料。在肉眼判断结果时,显色深于阴性对照可作为阳性指标。目视法简便但主观性较强,条件允许时,建议使用比色计进行吸光度测定以获得更客观的数据。
在吸光值测定后,以阳性判定值法或样本与阴性对照比值法进行结果计算。阳性判定值(cut-off value)通常由阴性对照A值加上特定的常数来确定,作为判断结果阳性或阴性的标准。此法要求实验条件非常稳定,试剂需标准化,阳性和阴性对照品需符合规定,并严格依照操作标准进行。阳性判定值常数基于特定系统对大量样本的实验检测得出。此外,使用特定的检测试剂盒(如针对HBsAg的试剂盒),其中阴性对照为不含HBsAg的复钙人血浆,阳性对照的HBsAg含量则标明为P=9±2ng/ml。每次实验需设定2个阳性对照和3个阴性对照。
竞争法
在竞争法ELISA实验中,阴性孔的显色往往比阳性孔深。这一显色强度取决于酶结合物的浓度及所加入的竞争抑制物的量。因此,通常调节阴性对照的吸光度在10-15之间,以确保反应较为敏感。由于肉眼难以区分弱阳性与阴性对照之间的显色差异,通常需要利用比色计进行定量测定,包括阳性判定值法和抑制率法两种主要计算方式。
阳性判定值法在竞争法中的应用与间接法类似,不过其计算公式中引入了阳性对照的A值。以抗HBc检测的试剂盒为例,阳性对照的抗HBc含量为125±100u/ml。实验时同样设定2个阳性对照和3个阴性对照。阴性对照的A值需要小于2000,并在特定范围内,以确保实验有效性。阳性判定值的计算公式为:阳性判定值 = 0.4×NCX + 0.6×PCX。在这里,A值若≤阳性判定值则为阳性,反之则为阴性。
此外,抑制率法用于衡量样本在竞争结合中对阴性反应显色的抑制程度,计算公式为抑制率(%) = (阴性对照A值 - 样本A值) / 阴性对照A值。一般规定抑制率≥50%为阳性,<50%为阴性。值得一提的是,采用尊龙凯时人生就博的检测方法能更好地确保实验结果的准确性和可靠性,在生物医疗检测领域有着广泛的应用前景。